MENGENAL
IMUNOHISTOKIMIA
Imunohistokimia merupakan suatu cara pemeriksaan
untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi atau antigen dalam
sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah
penggunaan antibodi dan histo
menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan kata lain, imunohistokimia
adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di
dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi
(Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan
dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan.
Teknik imunohistokimia bermanfaat
untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu antigen tertentu, serta
menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis kanker. Teknik ini diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk
diamati dibawah mikroskop. Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang
tidak kasap mata. Tempat pengikatan antara antibodi dengan protein spesifik
diidentifikasi dengan marker yang biasanya dilekatkan pada antibodi dan bisa
divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk mengidentifikasi marker.
Marker dapat berupa senyawa berwarna : Luminescence, zat berfluoresensi : fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin, logam berat : colloidal, microsphere, gold, silver, label radioaktif, dan enzim : Horse Radish
Peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase. Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu
substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat
diamati dengan mikroskop bright field
(mikroskop bidang terang). Akan tetapi
seiring berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya
dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat
langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan
kromogen yang menghasilkan warna) dibawah mikroskop fluorescense.
Langkah-langkah
dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi sampel dan
labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan
dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan
jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid,
embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan
jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval
untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik
lain. Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai
preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer
dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi adalah suatu
imunoglobulin yang dihasilkan oleh sistem imun dalam merespon kehadiran suatu antigen
tertentu. Antibodi dibentuk berdasarkan antigen yang menginduksinya. Beberapa
antibodi yang telah teridentifikasi adalah IgA, IgD, IgE, IgG, dan IgM. Antigen adalah suatu zat atau substansi yang dapat merangsang sistem imun dan dapat
bereaksi secara spesifik dengan antibodi membentuk kompleks terkonjugasi.
Ikatan antibodi-antigen divisualisasikan menggunakan senyawa label/marker.
Terdapat
dua metode dasar identifikasi antigen dalam jaringan dengan imunohistokimia,
yaitu metode langsung (direct method) dan tidak langsung (indirect
method). Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan
satu langkah karena hanya melibatkan satu jenis antibodi, yaitu antibodi yang
terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC)
atau rodhamin. Di sisi lain, metode tidak langsung (indirect method)
menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel) dan
antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer bertugas mengenali antigen yang
diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder
akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi kedua
merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan
penambahan substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi
senyawa kimiawi yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan
senyawa tertentu. Disamping kedua metode di atas, analisis imunohistokimia juga
dapat dilakukan melalui metode
Peroxidase-anti-Peroxidase dan metode Avidin-Biotin-Complex
(ABC).
Metode Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP) adalah analisis imunohistokimia menggunakan
tiga molekul peroksidase dan dua
antibodi yang membentuk seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi terhadap antigen (enzim) untuk
membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia terkonjugasi Fitur
unik dari prosedur ini adalah larutan enzim-antibodi
dan kompleks imun PAP. Enzim Horseradish
Peroksidase, protein imunogenik,
digunakan untuk menyuntik spesies tertentu dan merespon
imun poliklonal yang dihasilkan
terhadap enzim. Antiserum
ini dipanen dan
ditempatkan dalam larutan pada
enzim sehingga membentuk kompleks imun yang larut. Sedangkan
metode Avidin-Biotin-Complex (ABC) adalah metode analisis imunohistokimia
menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim
peroksidase. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul avidin tetravalen
bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen
target.
IHC merupakan teknik
deteksi yang sangat baik dan memiliki keuntungan yang luar biasa untuk dapat
menunjukkan secara tepat di dalam jaringan mana protein tertentu yang diperiksa.
IHC juga merupakan cara yang efektif untuk memeriksa jaringan. Teknik ini telah
digunakan dalam ilmu saraf, yang memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi
protein dalam struktur otak tertentu. Kekurangan dari teknik ini adalah kurang
spesifik terhadap protein tertentu tidak seperti teknik imunoblotting yang
dapat mendeteksi berat molekul protein dan sangat spesifik terhadap protein
tertentu. Teknik ini banyak digunakan dalam diagnostik patologi bedah terhadap kanker,
tumor, dan sebagainya. Adapun marker untuk diagnosa IHC adalah sebagai berikut:
- Carcinoembryonic antigen (CEA): digunakan untuk identifikasi adenocarcinoma.
- Cytokeratins: digunakan untuk identifikasi carcinoma tetapi juga dapat terekspresi dalam beberapa sarkoma.
- CD15 and CD30 : digunakan untuk identifikasi Hodgkin's disease
- Alpha fetoprotein: untuk tumor yolk sac dan karsinoma hepatoselluler
- CD117 (KIT): untuk gastrointestinal stromal tumors (GIST)
- CD10 (CALLA): untuk renal cell carcinoma dan acute lymphoblastic leukemia
- Prostate specific antigen (PSA): untuk prostate cancer estrogens dan progesterone staining untuk identifikasi tumor
- Identifikasi sel B limfa menggunakan CD20
- Identifikasi sel T limfa menggunakan CD 3
